Prečo je potrebné pred sekvenovaním purifikovať produkty PCR?

2024 Autor: Stanley Ellington | [email protected]. Naposledy zmenené: 2023-12-16 00:22

Overenie požadovaného produkt je nevyhnutné , ktorá zahŕňa potvrdenie nedostatku nešpecifických Produkty a primerové diméry. Čistý je tiež zvyškom reakčnej zmesi nevyhnutné na odstránenie neinkorporovaných primérov a dNTP, ktoré môžu interferovať s následnými reakciami a viesť k nečitateľnej sekvencii.

Okrem toho, prečo je potrebné purifikovať produkty PCR?

Musíte purifikovať produkty PCR zbaviť sa nepoužitých primerov, nukleotidov a enzýmov s cieľom optimalizovať úspešnosť ligácie, ktorá udrží a sekvenuje produkt z PCR . Komu očistiť na PCR produkty používa sa vylučovacia chromatografia.

Niekto sa môže tiež opýtať, mali by ste purifikovať produkty PCR pred štiepením restrikčnou endonukleázou? Vačšina z obmedzenie enzýmy sú aktívne v PCR nárazníky. Pre klonovacie aplikácie, čistenie z PCR produkty pred štiepením je nevyhnutné na odstránenie aktívnej termofilnej DNA polymerázy prítomnej v PCR zmes. DNA polymerázy môžu zmeniť konce štiepenej DNA a znížiť výťažok ligácie.

Ľudia sa tiež pýtajú, ako pripravujete produkty PCR na sekvenovanie?

Priame sekvenovanie produktov PCR

1. UISTITE SA, že ste zosilnili správny fragment.
2. Musíte odstrániť všetky zvyškové priméry PCR a nezačlenené nukleotidy.
3. Ak budú PCR priméry aj sekvenačnými primérmi, uistite sa, že zodpovedajú našim podmienkam.
4. Vzorku príliš nekoncentrujte!

Môžete sekvenovať produkt PCR?

Priamy Sekvenovanie z PCR produkty . Sekvenovanie používa iba jeden primer namiesto dvoch použitých v PCR . Ak urobíš neodstraňujte oba základné nátery, budeš dostať dve sekvencie navrstvené na seba, ktoré nie sú čitateľné. Je v poriadku použiť a PCR základný náter pre sekvenovanie pokiaľ to zodpovedá našim podmienkam.